13 priedas
2-FENOKSIETANOLIO, 1-FENOKSIPROPAN-2-OLIO, METIL-, ETIL-, PROPIL-, BUTIL- IR BENZIL-4-HIDROKSIBENZOATO ATPAŽINIMAS IR JŲ KIEKIŲ NUSTATYMAS
I. ATPAŽINIMAS
1. Šis plonasluoksnės chromatografijos (TLC) metodas kartu su II skyriuje aprašytu kiekio nustatymo metodu taikomas 2-fenoksietanoliui, 1-fenoksipropan-2-oliui, metil-4-hidroksibenzoatui, etil-4-hidroksibenzoatui, propil-4-hidroksibenzoatui, butil-4-hidroksibenzoatui ir benzil-4-hidroksibenzoatui kosmetikos gaminiuose atpažinti.
2. Iš parūgštinto kosmetikos mėginio konservantai ekstrahuojami acetonu. Po filtravimo acetono tirpalas yra maišomas su vandeniu ir šarminėje terpėje riebalų rūgštys nusodinamos kalcio druskų pavidalu. Šarminis acetono ir vandens mišinys ekstrahuojamas dietileteriu, kad būtų pašalintos lipofilinės medžiagos. Parūgštinus konservantai ekstrahuojami dietileteriu. Ant silikageliu dengtos plonasluoksnės plokštelės užlašinama alikvotinė dietileterinio ekstrakto dalis. Plokštelę išryškinus, gauta chromatograma stebima UV šviesoje ir vizualizuojama naudojant Millono reagentą.
3. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni.
3.1. Distiliuotas arba lygiaverčio grynumo vanduo.
3.2. Acetonas.
3.3. Dietileteris.
3.4. n-pentanas.
3.5. Metanolis.
3.6. Acto rūgštis, ledinė.
3.7. Vandenilio chlorido tirpalas, 4 M.
3.8. Kalio hidroksido tirpalas, 4 M.
3.9. Kalcio chlorido dihidratas (CaCl2 ·2H2O).
3.10. Vizualizavimo reagentas – Millono reagentas. Millono reagentas (gyvsidabrio (II) nitratas) yra visiškai paruoštas tirpalas, kurį galima įsigyti prekyboje (Fluka 69820).
3.11. 2-fenoksietanolis.
3.12. 2-fenoksipropan-2-olis.
3.13. Metil-4-hidroksibenzoatas (metilparabenas).
3.14. Etil-4-hidroksibenzoatas (etilparabenas).
3.15. n-propil-4-hidroksibenzoatas (propilparabenas).
3.16. n-butil-4-hidroksibenzoatas (butilparabenas).
3.17. Benzil-4-hidroksibenzoatas (benzilparabenas).
3.18. Etaloniniai tirpalai: paruošiami kiekvienos etaloninės medžiagos 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 ir 3.17 0,1% (m/t) tirpalai metanolyje.
3.19. Judančiosios fazės tirpiklis: sumaišomos 88 tūrio dalys n-pentano (3.4) su 12 tūrio dalių ledinės acto rūgšties (3.6).
4. Priemonės
4.1. Vandens vonia, kurioje palaikoma 60oC temperatūra.
4.2. Ryškinimo kamera (be filtravimo popieriaus).
4.3. Ultravioletinės šviesos šaltinis, 254 nm.
4.4. Plonasluoksnės plokštelės, 20 cm x 20 cm, iš anksto padengtos 0,25 mm silikagelio 60F254 sluoksniu, su koncentravimo zona (Merk Nr. 11798, Darmstadt arba atitikmuo).
4.5. Džiovinimo spinta, palaikanti iki 105oC temperatūrą.
4.6. Karšto oro plaukų džiovintuvas.
4.7. Vilnonis dažų volelis, apytikriai 10 cm ilgio ir 3,5 cm išorinio skersmens. Vilnos sluoksnio storis 2–3 mm. Jeigu reikia, vilnos sluoksnis apkarpomas.
4.8. 50 ml stikliniai mėgintuvėliai su užsukamu dangteliu.
4.9. Elektrinė kaitinamoji plokštė su termostatiniu reguliatoriumi. Temperatūra nustatoma apie 800C. Kad vienodai pasiskirstytų šiluma, kaitinamoji plokštė uždengiama 20 cm x 20 cm dydžio, apie 6 mm storio aliuminine plokšte.
4.10. Įprasta laboratorinė įranga.
5. Darbo eiga
5.1. Mėginio paruošimas
5.1.1. 50 ml stikliniame mėgintuvėlyje su užsukamu dangteliu (4.8) pasveriama apie 1 g bandinio. Įlašinami keturi lašai vandenilio chlorido tirpalo (3.7) ir įpilama 40 ml acetono.
5.1.2. Didelio šarmingumo kosmetikos gaminių mėginiams, pavyzdžiui, tualetiniam muilui, įlašinama 20 lašų vandenilio chlorido tirpalo. Mėgintuvėlis užsukamas, mišinys atsargiai kaitinamas iki apytikriai 60oC, kad konservantai lengviau ekstrahuotųsi į acetono fazę, po to smarkiai kratomas vieną minutę.
5.1.3. Tirpalo pH matuojamas indikatoriniu popieriumi, tirpalo pH nustatomas ≤ 3, lašinant vandenilio chlorido tirpalą. Dar vieną minutę smarkiai kratoma.
5.1.4. Tirpalas atvėsinamas iki kambario temperatūros ir filtruojamas per filtravimo popierių į kūginę kolbą. Į 200 ml kūginę kolbą įpilama 20 ml filtrato, 60 ml vandens ir išmaišoma. Lašinant kalio hidroksido tirpalą (3.8), mišinio pH nustatomas apie 10, tikrinama pH indikatoriniu popieriumi.
5.1.5. Įdedama 1 g kalcio chlorido dihidrato (3.9) ir smarkiai kratoma. Tirpalas filtruojamas per filtravimo popierių į 250 ml dalijamąjį piltuvą, kuriame yra 75 ml dietileterio, ir smarkiai kratoma vieną minutę. Leidžiama fazėms atsiskirti, vandeninis sluoksnis surenkamas į 200 ml kūginę kolbą. Lašinant vandenilio chlorido tirpalą, tirpalo pH nustatomas apytikriai ties 2, tikrinama pH indikatoriniu popieriumi. Po to įpilama 10 ml dietileterio (3.3) ir stipriai 1 minutę purtoma. Leidžiama fazėms atsiskirti ir apie 2 ml dietileterio sluoksnio įpilama į 5 ml mėginio buteliuką.
5.2. Plonasluoksnė chromatografija (TLC)
5.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos plokštelė (4.4) dedama ant įkaitintos aliumininės plokštės (4.9). Užlašinama po 10 ml kiekvieno etaloninio tirpalo (3.18) ir 100 ml mėginio tirpalo (-ų) (5.1) ant TLC plokštelės koncentracijos zonos pradinės linijos.
5.2.2. Jeigu norima, kad būtų lengviau išgarinti tirpiklį, gali būti naudojama oro srovė. TLC plokštelė nukeliama nuo elektrinės kaitinamosios plokštės ir atvėsinama iki kambario temperatūros. Į ryškinimo kamerą (4.2) įpilama 100 ml judančiosios fazės tirpiklio (3.19).
5.2.3. Plokštelė nedelsiant dedama į neprisotintą kamerą ir ryškinama kambario temperatūroje, kol tirpiklio frontas nuo pagrindinės linijos pasislinks 15 cm. Plokštelė išimama iš ryškinimo kameros ir džiovinama plaukų džiovintuvu karšto oro srove.
5.2.4. Plokštelė apžiūrima UV šviesoje (4.3) ir pažymimos dėmių vietos. Plokštelė 30 minučių kaitinama džiovinimo spintoje (4.5) 100oC temperatūroje, siekiant pašalinti acto rūgšties perteklių. Chromatogramoje konservantai vizualizuojami Millono reagentu (3.10), panardinant dažų volelį (4.7) į reagentą ir traukiant jį per plonasluoksnės chromatografijos plokštelę, kol ji vienodai sudrėks. (Dėmės taip pat gali būti vizualizuojamos atsargiai užlašinant vieną lašą Millono reagento ant kiekvienos dėmės, išryškėjusios UV šviesoje).
5.2.5. 4-hidroksibenzenkarboksirūgšties esteriai išryškėja raudonomis dėmėmis, 2-fenoksietanolis ir 1-fenoksipropan-2-olis – geltonomis dėmėmis. Tačiau būtina atkreipti dėmesį į tai, kad pati 4-hidroksibenzenkarboksirūgštis, kuri gali būti mėginiuose kaip konservantas arba parabenų skilimo produktas, taip pat išryškėja raudona dėme (7.3 ir 7.4 punktai).
6. Atpažinimo eiga
6.1. Apskaičiuojamos kiekvienos dėmės Rf vertės. Mėginio tirpalo dėmės palyginamos su etaloninių tirpalų dėmėmis, lyginant jų Rf vertes, jų charakteristikas UV spinduliuotėje ir spalvą po vizualizavimo. Daromos preliminarios išvados apie konservantų tapatumą.
6.2. Jeigu išaiškėja, kad parabenų yra, turi būti atliekama II skyriuje aprašyta HPLC. Remiantis plonasluoksnės chromatografijos ir didelio slėgio skysčių chromatografijos rezultatais, patvirtinamas 2-fenoksietanolio, 1-fenoksipropan-2-olio ir parabenų buvimas.
7. Paaiškinimai
7.1. Kadangi Millono reagentas yra toksiškas, jį geriausia naudoti vienu iš aprašytų būdų. Nerekomenduojama purkšti.
7.2. Kiti junginiai, kuriuose yra hidroksilo grupių, Millono reagento paveikti, taip pat gali keisti spalvą.
7.3. 1 lentelėje nurodytos hRf vertės, naudojamos Rf vertėms nustatyti.
1 lentelė. hRf vertės
Cheminės medžiagos pavadinimas
hRf
Spalva
4-hidroksibenzenkarboksirūgštis
11
Raudona
Metilparabenas
12
Raudona
Etilparabenas
17
Raudona
Propilparabenas
21
Raudona
Butilparabenas
26
Raudona
Benzilparabenas
16
Raudona
2-fenoksietanolis
29
Geltona
1-fenoksipropan-2-olis
50
Geltona
7.4. 4-hidroksibenzenkarboksirūgštis ir metilparabenas arba benzilparabenas ir etilparabenas neatskiriami. Šių junginių atpažinimas turi būti patvirtinamas didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodu, aprašytu II skyriuje, bei mėginio sulaikymo trukmes palyginant su etaloninių medžiagų sulaikymo trukmėmis.
II. KIEKIO NUSTATYMAS
8. Šiuo metodu nustatomas 2-fenoksietanolio, 1-fenoksipropan-2-olio, metil-4-hidroksibenzoato, etil-4-hidroksibenzoato, propil-4-hidroksibenzoato, butil-4-hidroksibenzoato ir benzil-4-hidroksibenzoato kiekis kosmetikos gaminiuose.
9. Šiuo metodu nustatytų konservantų kiekiai išreiškiami masės procentais.
10. Mėginys parūgštinamas sieros rūgštimi ir po to suspenduojamas etanolio ir vandens mišinyje. Mišinys šiek tiek pakaitinamas, kad ištirptų lipidų fazė ir vyktų kiekybinis ekstrahavimas, po to mišinys filtruojamas.
11. Konservantai, esantys filtrate, nustatomi atvirkštinių fazių didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodu, vidiniu etalonu naudojant izopropil-4-hidroksibenzoatą.
12. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni ir tikti didelio slėgio skysčių chromatografijai.
12.1. Distiliuotas arba lygiaverčio grynumo vanduo.
12.2. Etanolis, absoliutusis.
12.3. 2-fenoksietanolis.
12.4. 1-fenoksipropan-2-olis.
12.5. Metil-4-hidroksibenzoatas (metilparabenas).
12.6. Etil-4-hidroksibenzoatas (etilparabenas).
12.7. n-propil-4-hidroksibenzoatas (propilparabenas).
12.8. Izopropil-4-hidroksibenzoatas (izopropilparabenas).
12.9. n-butil – 4-hidroksibenzoatas (butilparabenas).
12.10. Benzil-4-hidroksibenzoatas (benzilparabenas).
12.11. Tetrahidrofuranas.
12.12. Metanolis.
12.13. Acetonitrilas.
12.14. Sieros rūgšties tirpalas, 2 M.
12.15. Etanolio ir vandens mišinys: sumaišomos devynios tūrio dalys etanolio (12.2) ir viena tūrio dalis vandens.
12.16. Vidinis etaloninis tirpalas: tiksliai pasveriama apie 0,25 g izopropilparabeno (12.8), perpilama į 500 ml matavimo kolbą, ištirpinama ir praskiedžiama iki žymės etanolio ir vandens mišiniu (12.15).
12.17. Judančiosios fazės tirpiklis – tetrahidrofurano, vandens, metanolio ir acetonitrilo mišinys: sumaišomos 5 tūrio dalys tetrahidrofurano (12.11), 60 tūrio dalių vandens (12.1), 10 tūrio dalių metanolio (12.12) ir 25 tūrio dalys acetonitrilo (12.13).
12.18. Pradinis konservanto tirpalas: 100 ml matavimo kolboje tiksliai pasveriama apie 0,2 g 2-fenoksietanolio (12.3), 0,2 g 1-fenoksipropan-2-olio (12.4), 0,05 g metilparabeno (12.5), 0,05 g etilparabeno (12.6), 0,05 g propilparabeno (12.7), 0,05 g butilparabeno (12.9) ir 0,025 g benzilparabeno (12.10), ištirpinama etanolio ir vandens mišinyje (12.15) ir skiedžiama juo iki žymės. Tirpalas, laikomas šaldytuve, yra patvarus vieną savaitę.
12.19. Etaloniniai konservanto tirpalai: į 50 ml matavimo kolbas įpilama 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml ir 1,00 ml pradinio tirpalo (12.18). Į kiekvieną kolbą įpilama 10,00 ml vidinio etaloninio tirpalo (12.16) ir 1,0 ml sieros rūgšties tirpalo (12.14), pripilama iki žymės etanolio ir vandens mišinio (12.15). Šie tirpalai turėtų būti paruošti prieš pat naudojimą.
13. Priemonės
13.1. Vandens vonia, kurioje palaikoma 600C 10C temperatūra.
13.2. Didelio slėgio skysčių chromatografas su UV detektoriumi, bangos ilgis – 280 nm.
13.3. Analizinė kolonėlė: nerūdijančio plieno, vidinis skersmuo 25 cm x 4,6 mm (arba 12,5 cm x 4,6 mm), įkrauta Nucleosil 5C18 arba jo atitikmeniu.
13.4. 100 ml stikliniai mėgintuvėliai su užsukamais dangteliais.
13.5. Netolygų kunkuliavimą slopinančios granulės, karborundas, 2–4 mm dydžio, arba jo atitikmuo.
13.6. Įprasta laboratorinė įranga.
14. Darbo eiga
14.1. Mėginių paruošimas
14.1.1. Mėginio paruošimas, nepridedant vidinio etaloninio tirpalo
14.1.1.1. 100 ml stikliniame mėgintuvėlyje su užsukamu dangteliu pasveriama apie 1,0 g bandinio. Pipete įpilama 1,0 ml sieros rūgšties tirpalo (12.14) ir 50,0 ml etanolio ir vandens mišinio (12.15). Pridedama apie 1 g netolygų kunkuliavimą slopinančių granulių (13.5), mėgintuvėlis užsukamas ir smarkiai kratomas, kol bus gauta vienalytė suspensija. Kratoma ne trumpiau kaip vieną minutę. Mėgintuvėlis penkioms minutėms dedamas į 60oC1oC temperatūros vandens vonią (13.1), kad konservantai lengviau ekstrahuotųsi į etanolio fazę.
14.1.1.2. Mėgintuvėlis nedelsiant atvėsinamas šalto vandens srove, ekstraktas laikomas šaldytuve vieną valandą. Ekstraktas filtruojamas per filtravimo popierių. Į 5 ml mėginio buteliuką įpilama apie 2 ml filtrato. Ekstraktai laikomi šaldytuve, HPLC metodu analizuojama per 24 valandas.
14.1.2. Mėginio paruošimas, pridedant vidinio etaloninio tirpalo
14.1.2.1. 100 ml stikliniame mėgintuvėlyje su užsukamu dangteliu vienos tūkstantosios gramo dalies tikslumu pasveriama 1,0 ± 0,1 g bandinio.
14.1.2.2. Į mėgintuvėlį pipete įpilama 1,0 ml sieros rūgšties tirpalo (12.14) ir 40,0 ml etanolio ir vandens mišinio (12.15). Pridedama apie 1 g netolygų kunkuliavimą slopinančių granulių (13.5) ir įpilama lygiai 10,00 ml vidinio etaloninio tirpalo (12.16). Mėgintuvėlis užsukamas ir smarkiai kratomas, kol bus gauta vienalytė suspensija. Kratoma ne trumpiau kaip vieną minutę. Mėgintuvėlis penkioms minutėms dedamas į 60oC±1oC temperatūros vandens vonią, kad konservantai lengviau ekstrahuotųsi į etanolio fazę.
14.1.2.3. Mėgintuvėlis nedelsiant atvėsinamas šalto vandens srove, ekstraktas laikomas šaldytuve vieną valandą. Ekstraktas filtruojamas per filtravimo popierių.
14.1.2.4. Į 5 ml mėginio buteliuką įpilama apie 2 ml filtrato (mėginio tirpalas). Ekstraktas laikomas šaldytuve. Didelio slėgio skysčių chromatografinis nustatymas atliekamas per 24 valandas.
14.2. Didelio slėgio skysčių chromatografija (HPLC)
14.2.1. Judančiosios fazės tirpiklis – tetrahidrofurano, vandens, metanolio ir acetonitrilo mišinys (12.17); srauto greitis – 1,5 ml/min.; aptikimo bangos ilgis – 280 nm.
14.2.2. Įšvirkščiama po 10 ml kiekvieno etaloninio konservanto tirpalo (12.19). Iš gautų chromatogramų nustatomi etaloninių konservantų tirpalų smailių aukščių ir vidinio etaloninio tirpalo smailės aukščio santykiai. Kiekvienam konservantui brėžiama šių santykių priklausomybės nuo etaloninių tirpalų koncentracijų kalibracinė kreivė.
14.3. Kiekio nustatymo eiga
14.3.1. Į chromatografą įšvirkščiama 10 ml mėginio tirpalo be vidinio etaloninio tirpalo (14.1.1) ir užrašoma chromatograma.
14.3.2. Įšvirkščiama 10 ml vieno iš etaloninių konservantų tirpalų (4.19) ir užrašoma chromatograma. Gautos chromatogramos palyginamos.
14.3.3. Jeigu mėginio ekstrakto (14.1.1) chromatogramoje nėra smailės, turinčios beveik tokią pačią sulaikymo trukmę kaip izopropilparabeno (rekomenduojamos vidinės etaloninės medžiagos), įšvirkščiama 10 ml mėginio tirpalo su vidine etalonine medžiaga (14.1.2). Užrašoma chromatograma ir matuojami smailių aukščiai.
14.3.4. Jeigu mėginio tirpalo chromatogramoje matoma trukdžių smailė, kurios sulaikymo trukmė beveik tokia pati kaip izopropilparabeno, turi būti parenkama kita vidinė etaloninė medžiaga.
14.3.5. Jeigu mėginio chromatogramoje nėra vieno iš tiriamų konservantų, šį konservantą galima naudoti pakaitine vidine etalonine medžiaga.
14.3.6. Apskaičiuojamas tiriamų konservantų smailių aukščių ir vidinės etaloninės medžiagos smailės aukščio santykis.
14.3.7. Įsitikinama, kad etaloniniai tirpalai, naudoti kalibravimui, turi tiesinę priklausomybę.
14.3.8. Įsitikinama, ar gautos etaloninio tirpalo ir mėginio tirpalo chromatogramos atitinka šiuos reikalavimus:
14.3.8.1. mažiausiai atskirtos poros smailių atskyrimas yra ne mažesnis kaip 0,90. Smailių atskyrimas nustatomas taip, kaip parodyta 1 pav. Jeigu negauta reikiamo smailių atskyrimo, turėtų būti naudojama arba labiau tinkanti kolonėlė, arba judančiosios fazės tirpalo sudėtis turėtų būti derinama, kol atitiks reikalavimus;
1 pav. Smailių atskyrimas
14.3.8.2. visų gautų smailių asimetrijos koeficientas As turi svyruoti tarp 0,9 ir 1,5. Smailių asimetrijos koeficientas nustatomas taip, kaip parodyta 2 pav. Rekomenduojama, kad savirašio greitis užrašant asimetrijos koeficiento nustatymo chromatogramą, būtų ne mažesnis kaip 2 cm/min.;
2 pav. Smailių asimetrijos koeficientas
14.3.8.3. turi būti gaunama nekintama pagrindinė linija.
14.3.9. Tirpinių sulaikymo trukmė vykdant didelio slėgio skysčių chromatografiją (HPLC) priklauso nuo nuostoviosios fazės tipo, klasės ir kitimo laike. Ar kolonėlė gali būti naudojama tiriamų konservantų atskyrimui, galima spręsti remiantis duomenimis, gautais etaloniniams tirpalams (14.3 punktas). Nustatyta, kad kolonėlei tinka naudoti ne tik pasiūlytą įkrovos medžiagą, bet ir Hypersil ODS ir Zorbax ODS. Numatant analizinę kolonėlę, gali būti numatyta ir tinkama apsauginė kolonėlė.
14.3.10. Norint gauti reikiamą atskyrimą, gali būti optimizuojama judančiosios fazės tirpalo sudėtis.
14.3.11. Esant šiame metode apibūdintoms sąlygoms, dauguma kitų sudedamųjų dalių, pavyzdžiui, konservantai ir kosmetiniai priedai, taip pat yra išplaunami. Daugumos konservantų, paminėtų Lietuvos higienos normoje HN 62:2001 [3.2], sulaikymo trukmės yra išvardytos leidinyje N. de Kruijf, M. A. H. Rijk, L. A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1989). Determination of preservatives in cosmetic products II. High performance liquid chromatographic identification (J. Chromatography 469, 317-398).
15. Apskaičiavimas. Kalibracinė kreivė (14.2.2) ir tiriamų konservantų smailių aukščių ir vidinės etaloninės medžiagos smailės aukščio santykiai yra naudojami konservantų koncentracijoms mėginio tirpale apskaičiuoti. 2-fenoksietanolio, 1-fenoksipropan-2-olio, metil-4-hidroksibenzoato, etil-4-hidroksibenzoato, propil-4-hidroksibenzoato, butil-4-hidroksibenzoato ir benzil-4-hidroksibenzoato kiekiai wi mėginyje apskaičiuojami masės procentais (% m/m), pagal formulę: [formulė šaltinio tekste pateikta paveikslėliu – žr. e-tar.lt]
% wi (m/m) = ,
čia: bi – konservanto i koncentracija mėginio tirpale, gauta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); a – mėginio masė (g).
III. Pakartojamumas IR REZULTATŲ ATITIKIMAS
16. Šis metodas buvo nagrinėjamas bendrame bandyme, kuriame dalyvavo devynios laboratorijos. Buvo išanalizuoti trys mėginiai. Lentelėje pateikiamos trijuose mėginiuose nustatytos analičių kiekio % m/m (m), rezultatų pakartojamumo (r), rezultatų atitikimo (R) vidutinės reikšmės.
1 lentelė. Analičių kiekio, rezultatų pakartojamumo ir rezultatų atitikimo reikšmės
Bandinys
2-fenoksietanolis
1-fenoksi-propan-2-olis
Metil-parabenas
Etil-parabenas
Propil-parabenas
Butil-parabenas
Benzil-parabenas
Vitaminizuotas kremas
m r R
1,124 0,016 0,176
0,250 0,018 0,030
0,0628 0,0035 0,0068
0,031 0,0028 0,0111
0,0906 0,0044 0,0034
Greitai susigeriantis kremas
M r R
1,196 0,040 0,147
0,266 0,003 0,022
0,076 0,002 0,004
Masažinis kremas
M r R
0,806 0,067 0,112
0,180 0,034 0,078
0,148 0,013 0,012
0,152 0,015 0,016
17. Aprašyto metodo rezultatų pastovumo tyrimo rezultatai parodė, kad nedidelis aptikimo bangos ilgio pakeitimas gali turėti didelės įtakos nustatymo rezultatams. Todėl analizės metu šis parametras turi būti atidžiai kontroliuojamas.