14 priedas

I. ATPAŽINIMAS

1. Šis metodas taikomas alfa-monogliceril-4-aminobenzoatui (glicerolio 1-(4-aminobenzoatui) atpažinti. Kartu atpažįstamas ir etil-4-aminobenzoatas (benzokainas INN), kurio gali būti kaip priemaišų.

2. Atpažinimas atliekamas plonasluoksnės chromatografijos metodu ant silikagelio su fluorescenciniu indikatoriumi, nustatant laisvąją pirminio amino grupę, sudarančią diazodažiklį ant plokštelės.

3. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni.

3.1. Tirpiklių mišinys: cikloheksanas, 2-propanolis, stabilizuotas dichlormetanas 48/64/9 (t/t/t).

3.2. Judančiosios fazės tirpiklis: petroleteris (40–60), benzenas, acetonas, amonio hidroksido tirpalas (mažiausiai 25% NH3): 35/35/35/1 (t/t/t/t).

3.3. Judančiosios fazės tirpalai

3.3.1. Natrio nitritas: 1 g 100-te ml 1 M vandenilio chlorido (paruošiamas prieš pat naudojimą);

3.3.2. 2-naftolis: 0,2 g 100-te ml 1 M kalio hidroksido.

3.4. Etaloniniai tirpalai

3.4.1. alfa-monogliceril-4-aminobenzoatas: 0,05 g 100-te ml tirpiklių mišinio (3.1);

3.4.2. etil-4-aminobenzoatas: 0,05 g 100-te ml tirpiklių mišinio (3.1).

3.5. Silikagelio 60 F254 plokštelės, 0,25 mm storio, 200 mm x 200 mm.

4. Priemonės

4.1. Įprasti plonasluoksnės chromatografijos prietaisai.

4.2. Ultragarso vibratorius.

4.3. Miliporų filtras FH 0,5 mm arba jo atitikmuo.

5. Darbo eiga

5.1. Mėginio paruošimas. 10 ml užkemšamoje matavimo kolboje pasveriama 1,5 g analizuojamo bandinio. Pripilama iki žymės tirpiklių mišinio (3.1). Užkemšama ir paliekama vienai valandai kambario temperatūroje ultragarso vibratoriuje (4.2). Filtruojama per miliporų filtrą (4.3); šis filtratas naudojamas chromatografijai.

5.2. Plonasluoksnė chromatografija. 10 ml mėginio tirpalo (5.1) ir kiekvieno etaloninio tirpalo (3.4) užlašinama ant plokštelės (3.5). Chromatograma ryškinama iki 150 mm aukščio kameroje, iš anksto prisotintame tirpiklio (3.2). Plokštelė išdžiovinama kambario temperatūroje.

5.3. Ryškinimas.

5.3.1. Plokštelė stebima UV šviesoje, esant 254 nm bangos ilgiui.

5.3.2. Išdžiovinta plokštelė apipurškiama 3.3.1 tirpalu.

5.3.3. Džiovinama kambario temperatūroje 1 minutę ir nedelsiant apipurškiama 3.3.2 tirpalu.

5.3.4. Plokštelė džiovinama 600C temperatūros džiovinimo spintoje. Atsiranda oranžinės spalvos dėmės. Alfa-monogliceril-4-aminobenzoato RF 0,07, etil-4-aminobenzoato RF 0,55.

II. KIEKIO NUSTATYMAS

6. Šis metodas taikomas alfa-monogliceril-4-aminobenzoato kiekiui, jeigu šis kiekis neviršija 5% (m/m), taip pat ir etil-4-aminobenzoato kiekiui, jeigu jis neviršija 1% (m/m), nustatyti.

7. Alfa-monogliceril-4-aminobenzoato ir etil-4-aminobenzoato kiekis mėginyje, nustatytas šiuo metodu, yra išreiškiamas masės procentais (% m/m).

8. Analizuojamas mėginys yra suspenduojamas metanolyje ir, tinkamai paruošus mėginį, tiriamas didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) būdu.

9. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni ir tiktų atliekamai HPLC:

9.1. Metanolis.

9.2. Kalio dihidroortofosfatas (KH2PO4).

9.3. Cinko diacetatas (Zn(CH3COO)2 × 2H2O).

9.4. Acto rūgštis (d= 1,05).

9.5. Tetrakalio heksacianoferatas (K4(Fe(CN)6) × 3H2O).

9.6. Etil-4-hidroksibenzoatas.

9.7. Alfa-monogliceril-4-aminobenzoatas.

9.8. Etil-4-aminobenzoatas.

9.9. Fosfatinis buferinis tirpalas (0,02 M): 2,72 g kalio dihidroortofosfato (9.2) ištirpinama viename litre vandens.

9.10. Eliuentas: fosfatinis buferinis tirpalas (9.9) ir metanolis (9.1) 61/39 (t/t).

Judančiosios fazės sudėtis gali būti keičiama, kad būtų galima gauti sklaidos koeficientą R ≥ 1,5.

R = 2 ,

čia: R1 ir R2 – smailių sulaikymo trukmė minutėmis; W1 ir W2 – smailių plotis pusėje aukščio milimetrais; d¢ – savirašio greitis milimetrais per minutę.

9.11. Pradinis alfa-monogliceril-4-aminobenzoato tirpalas: tiksliai pasveriama apie 40 mg alfa-monogliceril-4-aminobenzoato ir suberiama į 100 ml matavimo kolbą. Ištirpinama 40 ml metanolio (9.1). Pripilama iki žymės buferinio tirpalo (9.9) ir išmaišoma.

9.12. Pradinis etil-4-aminobenzoato tirpalas: tiksliai pasveriama apie 40 mg etil-4-aminobenzoato ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Ištirpinama 40 ml metanolio (9.1). Pripilama iki žymės buferinio tirpalo (9.9) ir išmaišoma.

9.13. Vidinis etaloninis tirpalas: tiksliai pasveriama apie 50 mg etil-4-hidroksi–benzoato (9.6), suberiama į 100 ml matavimo kolbą, ištirpinama 40 ml metanolio (9.1), pripilama iki žymės buferinio tirpalo (9.9) ir išmaišoma.

9.14. Etaloniniai tirpalai: paruošiami keturi etaloniniai tirpalai ištirpinant 100-e ml eliuento (9.10) pagal 1 lentelę (jie gali būti paruošiami ir kitokiu būdu).

1 lentelė. Etaloninių tirpalų koncentracija

Etaloninis tirpalas

Alfa-monogliceril-4-aminobenzoato

Etil-4-aminobenzoato

Etil-4-hidroksibenzoato

(mg/ml)*

ml (9.11)

(mg/ml)*

ml (9.12)

(mg/ml)*

ml (9.13)

I II II IV

8 16 24 40

2 4 6 10

8 12 16 20

2 3 4 5

50 50 50 50

10 10 10 10

* Šios vertės yra pateiktos kaip nuoroda ir atitinka tikslias 9.11, 9.12 ir 9.13 mases.

9.15. Carrez I tirpalas: 26,5 g tetrakalio heksacianoferato (9.5) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 250 ml.

9.16. Carrez II tirpalas: 54,9 g cinko diacetato (9.3) ir 7,5 ml acto rūgšties (9.4) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 250 ml.

9.17. Merck Lichrosorb RP-18 arba jo atitikmuo, vidutinis dalelių dydis – 5 mm.

10. Priemonės

10.1. Įprasta laboratorinė įranga.

10.2. Didelio slėgio chromatografijos įranga su kintamo bangos ilgio UV detektoriumi ir termostatinė kamera, kurioje nustatyta 45oC temperatūra.

10.3. Nerūdijančio plieno kolonėlė: ilgis – 250 mm; vidaus skersmuo – 4,6 mm; įkrova – Lichrosorb RP-18 (9.17).

10.4. Ultragarso vonia.

11. Darbo eiga

11.1. Mėginio paruošimas

11.1.1. 100 ml laboratorinėje stiklinėje tiksliai pasveriama apie 1 g bandinio ir įpilama 10 ml metanolio (9.1).

11.1.2. Laboratorinė stiklinė 20 minučių dedama į ultragarso vonią (10.4), kad susidarytų suspensija. Tokiu būdu gauta suspensija visa perpilama į 100 ml matavimo kolbą, kurioje yra ne daugiau kaip 75 ml eliuento (9.10).

11.1.3. Paeiliui įpilama 1 ml Carrez I tirpalo (9.15) ir 1 ml Carrez II tirpalo (9.16), kiekvieną kartą suplakant. Pripilama iki žymės eliuento (9.10), dar kartą išmaišoma ir filtruojama per lankstytąjį filtravimo popierių.

11.1.4. Į 50 ml matavimo kolbą pipete įpilama 3,0 ml filtrato, gauto pagal 11.1.2, ir 5,0 ml vidinio etaloninio tirpalo (9.13). Pripilama iki žymės eliuento (9.10) ir išmaišoma. Tokiu būdu gautas tirpalas naudojamas 11.2 punkte apibūdintai chromatografijai atlikti.

11.2. Chromatografija

11.2.1. Nustatoma, kad judančiosios fazės (9.10) srauto greitis būtų lygus 1,2 ml/min., o kolonėlės temperatūra – 45oC.

11.2.2. Detektoriaus (10.2) bangos ilgis nustatomas ties 274 nm.

11.2.3. Mikrošvirkštu ne mažiau kaip du kartus į chromatografą įšvirkščiama po 20 ml tirpalo (11.1.4) ir matuojami smailių plotai.

11.3. Kalibracinė kreivė

11.3.1. Įšvirkščiama po 20 ml kiekvieno etaloninio tirpalo (9.14) ir matuojamas smailės plotas.

11.3.2. Kiekvienai koncentracijai apskaičiuojamas alfa-monogliceril-4-aminobenzoa-to smailių plotų ir vidinio etaloninio tirpalo smailių plotų skirtumas. Šis santykis pažymimas ant abscisės, o atitinkamų masių santykis – ant ordinatės ašies.

11.3.3. Tokie patys veiksmai atliekami su etil-4-hidroksibenzoatu.

12. Apskaičiavimas

12.1. Iš kalibracinės kreivės, gautos pagal 11.3 punktą, užrašomi masių santykiai (RP1 ir RP2), atitinkantys smailių, apskaičiuotų pagal 11.2.3 punktą, plotų santykius, kai:

12.1.1. RP1 – alfa-monogliceril-4-aminobenzoato masė/etil-4-hidroksibenzoato masė,

12.1.2. RP2 – etil-4-aminobenzoato masė/etil-4-hidroksibenzoato masė.

12.2. Iš tokiu būdu gautų masių santykių apskaičiuojamas alfa-monogliceril-4-aminobenzoato ir etil-4-aminobenzoato kiekis masės procentais (% m/m) pagal šią formulę: [formulė šaltinio tekste pateikta paveikslėliu – žr. e-tar.lt]

Rp% (m/m) alfa-monogliceril-4-aminobenzoato = RP1 x ,

Rp% (m/m) etil-4-aminobenzoato = RP2 x ,

čia: q – pasverto etil-4-hidroksibenzoato (vidinės etaloninės medžiagos) kiekis miligramais (pagal 9.12); p – pasverto bandinio kiekis gramais (pagal 11.1.1).

III. PAKARTOJAMUMAS

13. Jeigu alfa-monogliceril-4-aminobenzoato kiekis sudaro 5% (m/m), dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,25%.

14. Jeigu etil-4-aminobenzoato kiekis sudaro 1% (m/m), dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas neturi viršyti 0,10%.

15. Prieš atliekant analizę patikrinama, ar bandinyje nėra medžiagų, galinčių uždengti vidinės etaloninės medžiagos (etil-4-aminobenzoato) smailę chromatogramoje.

16. Norint patikrinti, ar nėra trukdžių, nustatymas pakartojamas pakeičiant metanolio santykį judančiojoje fazėje atitinkamai 10%.