16 priedas

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Čia aprašomi metodai taikomi šių kosmetikos gaminių ingredientams atpažinti ir kiekiui nustatyti:

1.1. heksamidino ir jo druskų, taip pat ir izetionato ir 4-hidroksibenzoato;

1.2. dibromheksamidino ir jo druskų, taip pat ir izetionato;

1.3. dibrompropamidino ir jo druskų, taip pat ir izetionato;

1.4. chlorheksidino diacetato, digliukonato ir dihidrochlorido.

2. Heksamidino, dibromheksamidino, dibrompropamidino ir chlorheksidino koncentracijos, nustatomos šiuo metodu, yra išreiškiamos masės procentais (% m/m).

3. Atpažįstama ir kiekis nustatomas naudojant jonų poras, atvirkštinių fazių didelio slėgio skysčių chromatografijos metodu (HPLC) ir naudojant ultravioletinį spektrofotometrinį detektorių. Heksamidinas, dibromheksamidinas, dibrompropamidinas ir chlorheksidinas atpažįstami pagal jų sulaikymo trukmę chromatografinėje kolonėlėje.

II. ATPAŽINIMAS

4. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni ir tinkami HPLC analizei.

4.1. Metanolis.

4.2. 1-heptansulfonrūgšties natrio druskos monohidratas.

4.3. Acto rūgštis, ledinė (d20 = 1,05 g/ml).

4.4. Natrio chloridas.

4.5. Judančiosios fazės:

4.5.1. I tirpiklis: 1-heptansulfonrūgšties natrio druskos monohidrato (4.2) 0,005 M tirpalas metanolyje (4.1), kurio pH, lašinant ledinę acto rūgštį (4.3), nustatomas 3,5.

4.5.2. II tirpiklis: 1-heptansulfonrūgšties natrio druskos monohidrato (4.2) 0,005 M tirpalas vandenyje, kurio pH, lašinant ledinę acto rūgštį (4.3), nustatomas 3,5.

Jeigu reikia pagerinti smailių formą, judančiosios fazės gali būti keičiamos ir paruošiamos taip:

4.5.3. I tirpiklis: 5,84 g natrio chlorido (4.4) ir 1,1013 g 1-heptansulfonrūgšties natrio druskos monohidrato (4.2) ištirpinama 100 ml vandens. Įpilama 900 ml metanolio (4.1) ir ledine acto rūgštimi (4.3) pH nustatomas 3,5;

4.5.4. II tirpiklis: 5,84 g natrio chlorido (4.4) ir 1,013 g 1-heptansulfonrūgšties natrio druskos monohidrato (4.2) ištirpinama viename litre vandens ir, lašinant ledinę acto rūgštį (4.3), pH nustatomas 3,5.

4.6. Heksamidino diizetionatas [C20H26N4O2 2C2H6O4S].

4.7. Dibromheksamidino diizetionatas [C20H24Br2N4O2 ·2C2H6O4S].

4.8. Dibromopropamidino diizetionatas [C17H18Br2N4O2 ·2C2H6O4S].

4.9. Chlorheksidino diacetatas [C22H30Cl2N10·2C2H4O2].

4.10. Etaloniniai tirpalai: paruošiami visų keturių (4.6–4.9) konservantų 0,05% (m/t) tirpalai I tirpiklyje (4.5.1).

4.11. 3,4,4¢-trichlorkarbanilidas (triklokarbanas).

4.12. 4,4¢-dichlor-3-trifluormetilkarbanilidas (halokarbanas).

5. Priemonės

5.1. Įprasta laboratorinė įranga.

5.2. Didelio slėgio skysčių chromatografas su keičiamo bangos ilgio UV detektoriumi.

5.3. Analizinė kolonėlė: nerūdijančio plieno, 30 cm ilgio, 4 mm vidinio skersmens, įkrauta m-Bondapack C18 10 mm arba jo atitikmeniu.

5.4. Ultragarso vonia.

6. Darbo eiga

6.1. Mėginio paruošimas. 10 ml matavimo kolboje pasveriama apie 0,5 g bandinio ir iki žymės pripilama I tirpiklio (4.5.1). Kolba dedama į ultragarso vonią (5.4) 10 minučių. Tirpalas filtruojamas arba centrifuguojamas. Filtratas arba virš nuosėdų esantis skystis surenkamas chromatografijai atlikti.

6.2. Chromatografija

6.2.1. Judančiosios fazės gradientai pateikiami 1 lentelėje.

1 lentelė. Tirpiklių judančiosios fazės

Laikas (min.)

I tirpiklis (%t/t) (4.5.1)

II tirpiklis (%t/t) (4.5.2)

0

50

50

15

65

35

30

65

35

45

50

50

6.2.2. Judančiosios fazės (1 lentelė) srauto greitis nustatomas 1,5 ml/min., kolonėlės temperatūra 35oC.

6.2.3. Nustatomas 264 nm detektoriaus bangos ilgis.

6.2.4. Įšvirkščiama 10 ml kiekvieno etaloninio tirpalo (4.10) ir užrašomos jų chromatogramos.

6.2.5. Įšvirkščiama 10 ml mėginio tirpalo (6.1) ir užrašoma jo chromatograma.

6.3. Atpažįstama, ar yra heksamidino, dibromheksamidino, dibrompropamidino arba chlorheksidino, lyginant pagal 6.2.5 užrašytos smailės (-ių) sulaikymo trukmę (-es) su etaloninių tirpalų, gautų pagal 6.2.4, trukmėmis.

III. Kiekio nustatymas

7. Darbo eiga

7.1. Etaloninių tirpalų paruošimas:

7.1.1. Vidine etalonine medžiaga naudojamas vienas iš konservantų (4.6 – 4.9), kurio nėra mėginyje. Jeigu tai neįmanoma, gali būti naudojamas triklokarbanas (4.11) arba halokarbanas (4.12).

7.1.2. Konservanto, atpažinto pagal 6.3, 0,05% (m/t) pradinis tirpalas I tirpiklyje (4.5.1).

7.1.3. Konservanto, pasirinkto vidine etalonine medžiaga, 0,05% (m/t) pradinis tirpalas I tirpiklyje (4.5.1).

7.1.4. Kiekvienam atpažintam konservantui paruošiami keturi etaloniniai tirpalai, įpilant į 10 ml matavimo kolbas 2 lentelėje pateiktus nustatyto konservanto (7.1.2) ir atitinkamus vidinės etaloninės medžiagos pradinio tirpalo (7.1.3) kiekius. Kiekviena kolba pripilama iki žymės I tirpiklio (4.5.1), išmaišoma.

2 lentelė. Etaloninių tirpalų koncentracija

Etaloninis tirpalas

Pradinis vidinis etaloninis tirpalas

Pradinis identifikuoto konservanto tirpalas

įpilama (7.1.3) ml

įpilama (7.1.2) ml

mg/ml*

I

1,0

0,5

25

II

1,0

1,0

50

III

1,0

1,5

75

IV

1,0

2,0

100

* Šios vertės pateiktos kaip nuoroda ir atitinka atpažinto konservanto koncentracijas etaloniniuose tirpaluose, paruoštuose naudojant pirminį tirpalą, kuriame yra tiksliai 0,05% atpažinto konservanto.

7.2. Mėginio paruošimas:

7.2.1. 10 ml matavimo kolboje tiksliai pasveriama apie 0,5 g (p gramų) bandinio, įpilama 1,0 ml vidinio etaloninio tirpalo (7.1.3) ir 6 ml I tirpiklio (4.5.1), išmaišoma.

7.2.2. Kolba 10 minučių dedama į ultragarso vonią (5.4). Atvėsinama. Pripilama iki žymės I tirpiklio (4.5.1) ir išmaišoma. Centrifuguojama arba filtruojama per lankstytąjį filtravimo popierių. Virš nuosėdų esantis skystis arba filtratas (priklausomai nuo atliktos procedūros) naudojamas chromatografijai atlikti.

7.3. Chromatografija:

7.3.1. Nustatomas HPLC įrangos judančiosios fazės gradientas, debitas, kolonėlės temperatūra ir HPLC įrangos (5.2) detektoriaus bangos ilgis pagal reikalaujamas atpažinimo etapų (6.2.1 – 6.2.3) sąlygas.

7.3.2. Įšvirkščiama 10 ml mėginio tirpalo (7.2.2) ir išmatuojamas smailės plotas. Ši darbo eiga kartojama, pilant po 10 ml (alikvotinė dalis) mėginio tirpalo, kol bus gauti pastovūs rezultatai. Apskaičiuojamas analizuojamo junginio smailės ploto ir vidinio etaloninio tirpalo smailės ploto santykis.

7.4. Kalibravimas:

7.4.1. Įšvirkščiama po 10 ml kiekvieno etaloninio tirpalo (7.3.1) ir matuojami smailių plotai.

7.4.2. Kiekvienam etaloniniam tirpalui (7.1.4) apskaičiuojamas heksamidino, dibromheksamidino, dibrompropamidino arba chlorheksidino smailės ploto ir vidinio etaloninio tirpalo smailės ploto santykis. Kalibracinė kreivė brėžiama atidedant šiuos santykius ordinatės ašyje, o atitinkamas etaloniniuose tirpaluose esančio identifikuoto konservanto koncentracijas mikrogramais mililitre – abscisės ašyje.

7.4.3. Iš kalibracinės kreivės (7.4.2) nustatoma atpažinto konservanto koncentracija, atitinkanti pagal 7.3.2 apskaičiuotą smailės ploto santykį.

8. Apskaičiavimas. Heksamidino, dibromheksamidino, dibrompropamidino arba chlorheksidino kiekis mėginyje apskaičiuojamas masės procentais pagal formulę: [formulė šaltinio tekste pateikta paveikslėliu – žr. e-tar.lt]

% (m/m) = ,

čia: p – analizei paimto mėginio (7.2.1) masė gramais; c – konservanto koncentracija mėginio tirpale, nustatyta iš kalibracinės kreivės, mikrogramais mililitre; MW1 – konservanto pagrindinės formos molekulinė masė; MW2 – atitinkamos druskos (9 punktas) molekulinė masė.

9. Ingredientų cheminių formulių ir molekulinių masių lentelė

Heksamidinas

C20H26N4O2

354,45

Heksamidino diizetionatas

C20H26N4O2· 2C2H6O4S

606,72

Heksamidino di-p-hidroksibenzoatas

C20H26N4O2 ·2C7H6O3

630,71

Dibromheksamidinas

C20H24Br2N4O2

512,24

Dibromheksamidino diizetionatas

C20H24Br2N4O2 ·2C2H6O4S

764,51

Dibrompropamidinas

C17H18Br2N4O2

470,18

Dibrompropamidino diizetionatas

C17H18Br2N4O2·2 C2H6O4S

722,43

Chlorheksidinas

C22H30Cl2N10

505,45

Chlorheksidino diacetatas

C22H30Cl2N10·2 C2H4O2

625,56

Chlorheksidino digliukonatas

C22H30Cl2N10 ·2C6H12O7

897,76

Chlorheksidino dihidrochloridas

C22H30Cl2N10 ·2 HCl

578,37

IV. Pakartojamumas

10. Jeigu heksamidino, dibromheksamidino, dibrompropamidino arba chlorheksidino koncentracija sudaro 0,1% (m/m), dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,005%.