17 priedas

I. ATPAŽINIMAS

1. Šis metodas taikomas hidrochinonui, hidrochinono monometileteriui, hidrochinono monoetileteriui ir hidrochinono monobenzileteriui (monobenzonui) atpažinti odos šviesinimui skirtuose kosmetikos gaminiuose.

2. Hidrochinonas ir jo eteriai atpažįstami plonasluoksnės chromatografijos (TLC) metodu.

3. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni.

3.1. Etanolis, 96% (t/t).

3.2. Chloroformas.

3.3. Dietileteris.

3.4. Judančiosios fazės tirpiklis – chloroformas ir dietileteris, 66: 33 (t/t).

3.5. Amoniakas, 25% (m/m) (d = 0,91 g/ml).

3.6. Askorbo rūgštis.

3.7. Hidrochinonas.

3.8. Hidrochinono monometileteris.

3.9. Hidrochinono monoetileteris.

3.10. Hidrochinono monobenzileteris (monobenzonas).

3.11. Etaloniniai tirpalai (jie turi būti paruošti prieš pat naudojimą ir yra patvarūs vieną dieną):

3.11.1. 10 ml graduotame mėgintuvėlyje pasveriama 0,05g hidrochinono (3.7). Pridedama 0,250 g askorbo rūgšties (3.6) ir 5 ml etanolio (3.1). Lašinamas amoniakas (3.5), kol pH pasieks 10, ir pripilama iki 10 ml tūrio etanolio (3.1).

3.11.2. 10 ml graduotame mėgintuvėlyje pasveriama 0,05g hidrochinono monometileterio (3.8). Pridedama 0,250 g askorbo rūgšties (3.6) ir 5 ml etanolio (3.1). Lašinamas amoniakas (3.5), kol pH pasieks 10, ir pripilama iki 10 ml tūrio etanolio (3.1).

3.11.3. 10 ml graduotame mėgintuvėlyje pasveriama 0,05 g hidrochinono monoetileterio (3.9). Pridedama 0,250 g askorbo rūgšties (3.6) ir 5 ml etanolio (3.1). Lašinamas amoniakas (3.5), kol pH pasieks 10, ir pripilama iki 10 ml tūrio etanolio (3.1).

3.11.4. 10 ml graduotame mėgintuvėlyje pasveriama 0,05 g hidrochinono monobenzileterio (3.10). Pridedama 0,250 g askorbo rūgšties (3.6) ir 5 ml etanolio (3.1). Lašinamas amoniakas (3.5), kol pH pasieks 10, ir pripilama iki 10 ml tūrio etanolio (3.1).

3.12. Sidabro nitratas.

3.13. 12-molibdofosforo rūgštis:

3.14. Kalio heksacianoferatas (III), heksahidratas.

3.15. Geležies chloridas, heksahidratas.

3.16. Purškiamieji reagentai:

3.16.1. Į 5% (m/t) vandeninį sidabro nitrato tirpalą (3.12) lašinamas amoniakas (3.5), kol susidarančios nuosėdos ištirpsta. Laikomas tirpalas pasidaro nepatvarus, gali sprogti, todėl panaudotas turėtų būti išpilamas.

3.16.2. 10% (m/t) 12-molibdofosforo rūgšties (3.13) tirpalas etanolyje (3.1).

3.16.3. Paruošiamas 1% (m/t) vandeninis kalio heksacianoferato (3.14) tirpalas ir

2% (m/t) vandeninis geležies chlorido (3.15) tirpalas. Abu tirpalai sumaišomi lygiomis dalimis prieš pat vartojimą.

4. Priemonės

4.1. Įprasta plonasluoksnės chromatografijos (TLC) įranga.

4.2. TLC plokštelės, paruoštos naudoti: silikagelis GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel arba jų atitikmuo). Sluoksnio storis – 0,25 mm.

4.3. Ultragarso vonia.

4.4. Centrifuga.

4.5. UV lempa, 254 nm.

4.6. Įprasta laboratorinė įranga.

5. Darbo eiga

5.1. Mėginio paruošimas: 10 ml graduotame mėgintuvėlyje pasveriama 3,0 g bandinio. Pridedama 0,250 g askorbo rūgšties (3.6) ir 5 ml etanolio (3.1). Lašinamas amoniakas (3.5), kol pH pasieks 10. Pripilama iki 10 ml tūrio etanolio (3.1). Mėgintuvėlis užkemšamas kamščiu ir homogenizuojama ultragarso vonioje 10 minučių. Filtruojama per filtravimo popierių arba centrifuguojama, esant 3 000 aps./min.

5.2. Plonasluoksnė chromatografija:

5.2.1. Chromatografo kamera prisotinama judančiosios fazės tirpiklio (3.4).

5.2.2. Ant plokštelės užlašinama po 2 ml etaloninių tirpalų (3.11) ir 2 ml mėginio tirpalo (5.1). Ryškinama tamsoje, kambario temperatūroje, kol tirpiklio frontas pasislinks 15 cm nuo pradinės linijos.

5.2.3. Plokštelė išimama ir džiovinama kambario temperatūroje.

5.3. Aptikimas:

5.3.1. Plokštelė stebima UV šviesoje, esant 254 nm bangos ilgiui, pažymimos dėmių vietos.

5.3.2. Plokštelė apipurškiama:

5.3.2.1. sidabro nitrato reagentu (3.16.1) arba

5.3.2.2. 12-molibdofosforo rūgšties reagentu (3.16.2); kaitinama iki apytikriai 1200C, arba

5.3.2.3. kalio heksacianoferato tirpalu ir geležies chlorido tirpalu (3.16.3).

6. Atpažinimo eiga

6.1. Apskaičiuojama kiekvienos dėmės Rf vertė.

6.2. Gautos mėginio tirpalo dėmės palyginamos su etaloninių tirpalų dėmėmis, palyginant jų Rf vertes, dėmių spalvą, jas veikiant UV spinduliuote, ir dėmių spalvą, atsiradusią apipurškus purškiamuoju reagentu.

6.3. Atliekama didelio slėgio skysčių chromatografija, aprašyta II skyriuje, ir gautosios mėginio smailės (-ių) sulaikymo trukmės palyginamos su etaloninių tirpalų sulaikymo trukmėmis.

6.4. Remiantis plonasluoksnės chromatografijos ir didelio slėgio skysčių chromato-grafijos rezultatais, galima atpažinti hidrochinoną ir (arba) jo eterius.

6.5. Esant aprašytoms sąlygoms, buvo gautos tokios Rf vertės:

6.5.1. hidrochinono – 0,32;

6.5.2. hidrochinono monometileterio – 0,53;

6.5.3. hidrochinono monoetileterio – 0,55;

6.5.4. hidrochinono monobenzileterio – 0,58.

II. KIEKIO NUSTATYMAS

7. Šis metodas taikomas hidrochinono, hidrochinono monometileterio, hidrochinono monoetileterio ir hidrochinono monobenzileterio kiekiui nustatyti odos šviesinimui skirtuose kosmetikos gaminiuose.

8. Bandinys ekstrahuojamas vandens ir metanolio mišiniu atsargiai šildant, kad ištirptų visos lipidinės medžiagos. Gautame tirpale analitės kiekis nustatomas atvirkštinių fazių skysčių chromatografijos būdu, naudojant UV detektorių.

9. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni.

9.1. Distiliuotas arba lygiavertės kokybės vanduo.

9.2. Metanolis.

9.3. Hidrochinonas.

9.4. Hidrochinono monometileteris.

9.5. Hidrochinono monoetileteris.

9.6. Hidrochinono monobenzileteris (monobenzonas).

9.7. Tetrahidrofuranas, tinkantis didelio slėgio skysčių chromatografijai (HPLC).

9.8. Vandens ir metanolio mišinys 1:1 (t/t): sumaišoma viena tūrio dalis vandens (9.1) ir viena tūrio dalis metanolio (9.2).

9.9. Judančiosios fazės tirpiklis – tetrahidrofurano ir vandens mišinys 45:55 (t/t): sumaišomos 45 tūrio dalys tetrahidrofurano (9.7) ir 55 tūrio dalys vandens (9.1).

9.10. Etaloninis tirpalas:

9.10.1. 50 ml matavimo kolboje pasveriama 0,06 g hidrochinono (9.3), 0,08 g hidrochinono monometileterio (9.4), 0,10 g hidrochinono monoetileterio (9.5) ir 0,12 g hidrochinono monobenzileterio (9.6). Ištirpinama ir praskiedžiama metanoliu (9.2) iki žymės.

9.10.2. 10,00 ml šio tirpalo iki 50,00 ml praskiedžiama vandens ir metanolio mišiniu (9.8). Šie tirpalai turi būti paruošti prieš pat naudojimą.

10. Priemonės

10.1. Vandens vonia, kurioje palaikoma 600C temperatūra.

10.2. Didelio slėgio skysčių chromatografas su keičiamo bangos ilgio UV detektoriumi ir 10 ml įšvirkštimo kilpa.

10.3. Analizinė kolonėlė – nerūdijančio plieno chromatografinė kolonėlė, 250 mm ilgio, 4,6 mm vidinio skersmens, įkrauta Zorbax phenyl (chemiškai surištas fenetilsilanas ant Zorbax SIL, padengtas trimetilchlorosilanu), dalelių dydis – 6 mm, arba jo atitikmuo. Apsauginė kolonėlė nenaudojama, išskyrus fenilo kolonėlę arba jos atitikmenį.

10.4. Filtravimo popierius, 90 mm skersmens, Schleicher and Scull, Weissband No 5892 arba jo atitikmuo.

10.5. Įprasta laboratorinė įranga.

11. Darbo eiga

11.1. Mėginio paruošimas:

11.1.1. Vienos tūkstantosios gramo dalies tikslumu 50 ml matavimo kolboje pasveriama 10,1 g (a gramų) bandinio. Mėginys disperguojamas 25 ml vandens ir metanolio mišiniu (9.8). Kolba užkemšama ir smarkiai kratoma, kol susidarys vienalytė suspensija. Kratoma ne trumpiau kaip vieną minutę. Ekstrahavimui sustiprinti kolba dedama į 60oC temperatūros vandens vonią (10.1).

11.1.2. Kolba atvėsinama ir pripilama iki žymės vandens ir metanolio mišinio (9.8). Ekstraktas filtruojamas per filtravimo popierių (10.4). Analizuojama didelio slėgio skysčių chromatografijos metodu per 24 valandas po ekstrakto paruošimo.

11.2. Didelio slėgio skysčių chromatografija:

11.2.1. Judančiosios fazės tirpiklio (9.9) srauto greitis nustatomas 1,0 ml/min., detektoriaus bangos ilgis – 295 nm.

11.2.2. Įšvirkščiama 10 ml mėginio tirpalo, gauto pagal 11.1, ir užrašoma chromatograma. Matuojami smailių plotai. Kalibravimas atliekamas pagal 11.3 punkto aprašymą. Palyginamos gautos mėginio ir etaloninių tirpalų chromatogramos. Smailių plotai ir reaktingumo koeficientai (RF), gauti pagal 11.3 punktą, naudojami mėginio analičių koncentracijoms apskaičiuoti.

11.3. Kalibravimas:

11.3.1. Įšvirkščiama 10 ml etaloninio tirpalo (9.10) ir užrašoma chromatograma. Švirkščiama keletą kartų, kol bus gaunami pastovūs smailių plotai.

11.3.2. Nustatomas reaktingumo koeficientas RFi:

RFi = ,

čia: pi – hidrochinono, hidrochinono monometileterio, hidrochinono monoetileterio arba hidrochinono monobenzileterio smailės plotas; ci – hidrochinono, hidrochinono monometileterio, hidrochinono monoetileterio arba hidrochinono monobenzileterio koncentracija (g/50 ml) etaloniniame tirpale (9.10).

11.3.3. Patikrinama, ar gautos etaloninio tirpalo ir mėginio tirpalo chromatogramos atitinka šiuos reikalavimus:

11.3.3.1. mažiausiai atskirtos poros smailių atskyrimas yra ne mažesnis kaip 0,90. Smailių atskyrimas parodytas 1 pav. Jeigu reikalingas atskyrimas nepasiekiamas, turi būti naudojama labiau tinkanti kolonėlė arba judančiosios fazės tirpiklio sudėtis turėtų būti derinama, kol ji atitiks reikalavimus;

1 pav. Smailės atskyrimas

11.3.3.2. visų gautų smailių asimetrijos koeficientas As svyruoja tarp 0,9–1,5. Smailių asimetrijos koeficientas nustatomas taip, kaip pavaizduota 2 pav. Užrašant asimetrijos koeficiento nustatymo chromatogramą, rekomenduojamas ne mažesnis kaip 2 cm/min. savirašio greitis;

2 pav. Smailių asimetrijos koeficientas

11.3.3.3. turi būti gaunama nekintama pagrindinė linija.

11.3.4. Jeigu nustatoma, kad hidrochinono kiekis yra daug didesnis negu 2% ir reikia tiksliai nustatyti jo kiekį, mėginio ekstraktas (11.1) turi būti skiedžiamas iki tokios koncentracijos, kokia būtų gauta iš mėginio, turinčio 2% hidrochinono, o kiekio nustatymas turėtų būti pakartojamas.

11.3.5. Esant didelei hidrochinono koncentracijai, kai kuriuose prietaisuose absorbcija gali būti už detektoriaus tiesinio intervalo ribų.

12. Apskaičiavimas. Analičių smailių plotai naudojami analitės (-čių) koncentracijai (-oms) mėginyje apskaičiuoti. Analitės koncentracija mėginyje yra apskaičiuojama masės procentais (xi) pagal formulę: [formulė šaltinio tekste pateikta paveikslėliu – žr. e-tar.lt]

xi % (m/m) = ,

čia: a – mėginio masė gramais; bi – analitės mėginyje smailės plotas.

III. Pakartojamumas ir rezultatų atitikimas

13. Jeigu hidrochinono kiekis sudaro 2,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,13% absoliučios vertės.

14. Jeigu hidrochinono monometileterio kiekis sudaro 1,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,1% absoliučios vertės.

15. Jeigu hidrochinono monoetileterio kiekis sudaro 1,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,11% absoliučios vertės.

16. Jeigu hidrochinono monobenzileterio kiekis sudaro 1,0 %, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,11% absoliučios vertės.

17. Jeigu hidrochinono kiekis sudaro 2,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų, atliktų skirtingomis sąlygomis (skirtingos laboratorijos, skirtingi operatoriai, skirtingos priemonės ir (arba) skirtingas laikas), rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,37 % absoliučios vertės.

18. Jeigu hidrochinono monometileterio kiekis sudaro 1,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų, atliktų skirtingomis sąlygomis (skirtingos laboratorijos, skirtingi operatoriai, skirtingos priemonės ir (arba) skirtingas laikas), rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,21% absoliučios vertės.

19. Jeigu hidrochinono monoetileterio kiekis sudaro 1,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų, atliktų skirtingomis sąlygomis (skirtingos laboratorijos, skirtingi operatoriai, skirtingos priemonės ir (arba) skirtingas laikas), rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,19% absoliučios vertės.

20. Jeigu hidrochinono monobenzileterio kiekis sudaro 1,0%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų, atliktų skirtingomis sąlygomis (skirtingos laboratorijos, skirtingi operatoriai, skirtingos priemonės ir (arba) skirtingas laikas), rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,11% absoliučios vertės.

IV. galimi trukdžiai

21. Aprašytu metodu galima nustatyti hidrochinoną ir jo eterius paprastos izokratinės chromatografijos būdu. Fenilo kolonėlės naudojimas užtikrina pakankamą hidrochinono sulaikymą, kurio negalima garantuoti naudojant C18 kolonėlę su apibūdintuoju judančiosios fazės tirpalu.

22. Šiame metode dažnai susiduriama su trukdžiais, kuriuos sukelia parabenai. Tokiais atvejais nustatymas turėtų būti pakartojamas, naudojant kitokią judančiosios fazės ir nuostoviosios fazės sistemą:

22.1. kolonėlė – Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm arba jos atitikmuo: temperatūra – 36oC, srautas – 1,5 ml/min., judančiosios fazės tirpikliai: hidrochinonui – metanolis ir vanduo 5:95 (t/t), hidrochinono monometileteriui – metanolis ir vanduo 30:70(t/t), hidrochinono monobenzileteriui – metanolis ir vanduo 80:20 (t/t);

22.2. kolonėlė – Spherisorb S5-ODS arba jos atitikmuo: judančiosios fazės tirpiklis – metanolis ir vanduo 90:10 (t/t), srautas – 1,5 ml/min.

23. Šios sąlygos tinka hidrochinonui.