6 priedas
BENZILO ALKOHOLIO ATPAŽINIMAS IR KIEKIO NUSTATYMAS
I. Atpažinimas
1. Šis metodas taikomas benzilo alkoholiui kosmetikos gaminiuose atpažinti.
2. Benzilo alkoholis atpažįstamas plonasluoksnės chromatografijos, atliekamos ant silikagelio plokštelių, metodu.
3. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni.
3.1. Benzilo alkoholis.
3.2. Chloroformas.
3.3. Etanolis, absoliutusis.
3.4. N-pentanas.
3.5. Judančiosios fazės tirpiklis – dietileteris.
3.6. Etaloninis benzilo alkoholio tirpalas: 0,1 g benzilo alkoholio (3.1) pasveriama 100 ml matavimo kolboje, pripilama iki žymės etanolio (3.3) ir išmaišoma.
3.7. Plonasluoksnės chromatografijos plokštelės: stiklas, 100 x 200 mm arba 200 x 200 mm, padengtos 0,25 mm silikagelio 60 F254 sluoksniu.
3.8. Vizualizavimo reagentas – 12-molibdofosforo rūgštis 10 % (m/t) etanolyje (3.3).
4. Priemonės
4.1. Įprasta plonasluoksnės chromatografijos įranga.
4.2. Chromatografo kamera su dvigubu indu tirpikliams, kurios matmenys apytikriai 80 mm x 230 mm x 240 mm.
4.3. Chromatografinis popierius Whatman arba jo atitikmuo.
4.4. Ultravioletinė lempa, bangos ilgis – 254 nm.
5. Darbo eiga
5.1. Mėginio paruošimas. 10 ml matavimo kolboje pasveriama 1,0 g analizuotino bandinio. Įpilama 3 ml chloroformo (3.2) ir smarkiai kratoma, kol mėginys disperguosis. Pripilama iki žymės etanolio (3.3) ir smarkiai kratoma, kol susidarys skaidrus arba beveik skaidrus tirpalas.
5.2. Plonasluoksnė chromatografija
5.2.1. Chromatografo kamera (4.2) pripildoma n-pentano (3.4) taip: užpakalinio kameros indo sienelė išklojama chromatografiniu popieriumi (4.3) taip, kad popieriaus apačia būtų tirpiklyje. Į užpakalinį indą įpilama 25 ml n-pentano (3.4), šį tirpiklį pilant per chromatografinio popieriaus išklojos paviršių. Nedelsiant uždedamas dangtelis ir kamera paliekama 15 minučių.
5.2.2. 10 ml bandinio tirpalo (5.1) ir 10 ml etaloninio benzilo alkoholio tirpalo (3.6) užlašinama ant chromatografinės plokštelės (3.7) tinkamose pradinės linijos vietose. Leidžiama išdžiūti.
5.2.3. Į priekinį kameros indą pipete įpilama 10 ml dietileterio (3.5) ir plokštelė (5.2.2) nedelsiant dedama į šį indą. Greitai uždedamas kameros dangtis, plokštelė ryškinama iki 150 mm. Plokštelė išimama iš chromatografo kameros ir paliekama išdžiūti kambario temperatūroje.
5.2.4. Plokštelė (5.2.3) stebima ultravioletinėje šviesoje ir pažymimos violetinių dėmių vietos. Plokštelė apipurškiama vizualizavimo reagentu (3.8), po to kaitinama 1200C temperatūroje apie 15 minučių. Benzilo alkoholis išryškėja tamsiai mėlynomis dėmėmis.
5.2.5. Apskaičiuojama etaloninio benzilo alkoholio tirpalo R1 vertė. Turinti tą pačią R1 vertę tamsiai mėlyna dėmė, gauta iš mėginio tirpalo, rodo benzilo alkoholio buvimą. Aptikimo riba: 0,1 mg benzilo alkoholio.
II. Kiekio nustatymas
6. Benzilo alkoholio kiekis, nustatomas šiuo metodu, yra išreiškiamas masės procentais (% m/m).
7. Bandinys ekstrahuojamas metanoliu, o benzilo alkoholio kiekis ekstrakte nustatomas didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodu.
8. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni ir tinkantys HPLC.
8.1. Metanolis.
8.2. 4-etoksifenolis.
8.3. Benzilo alkoholis.
8.4. Judančioji fazė – metanolis (8.1) ir vanduo (45: 55; t/t).
8.5. Benzilo alkoholio pradinis tirpalas: 100 ml matavimo kolboje tiksliai pasveriama apie 0,1 g benzilo alkoholio (8.3). Iki žymės pripilama metanolio (8.1) ir išmaišoma.
8.6. Vidinis etaloninis pradinis tirpalas: 100 ml matavimo kolboje tiksliai pasveriama apie 0,1 g 4-etoksifenolio (8.2). Iki žymės pripilama metanolio (8.1) ir išmaišoma.
8.7. Etaloniniai tirpalai: į 25 ml matavimo kolbas pipete įpilama pradinio benzilo alkoholio tirpalo (8.5) ir vidinio etaloninio pradinio tirpalo (8.6) pagal 1 lentelę. Pripilama iki reikiamo tūrio metanolio (8.1) ir išmaišoma.
1 lentelė. Etaloninių tirpalų koncentracija
Etaloninis tirpalas
Benzilo alkoholio koncentracija
4-etoksifenolio koncentracija
įpilta (8.5) ml
mg/ml*
įpilta (8.6) ml
mg/ml*
I
0,5
20
2,0
80
II
1,0
40
2,0
80
III
2,0
80
2,0
80
IV
3,0
120
2,0
80
V
5,0
200
2,0
80
* Šios vertės yra pateiktos kaip nuoroda ir atitinka etaloninių tirpalų, paruoštų naudojant benzilo alkoholio (8.5) ir 4-etoksifenolio (8.6) tirpalus, koncentracijas, kuriose yra atitinkamai lygiai 0,1% (m/t) benzilo alkoholio ir lygiai 0,1% (m/t) 4-etoksifenolio.
9. Priemonės
9.1. Įprasta laboratorinė įranga.
9.2. Didelio slėgio skysčių chromatografijos įranga su keičiamo bangos ilgio UV detektoriumi ir 10 ml įšvirkštimo kilpa.
9.3. Analizinė kolonėlė: 250 mm x 4,6 mm nerūdijančio plieno kolonėlė, kurios įkrova – 5 mm Spherisorb ODS arba jo atitikmuo.
9.4. Vandens vonia.
9.5. Ultragarso vonia.
9.6. Centrifuga.
9.7. Centrifugos mėgintuvėliai, 15 ml tūrio.
10. Darbo eiga
10.1. Mėginio paruošimas
10.1.1. Centrifugos mėgintuvėlyje (9.7) tiksliai pasveriama apie 0,1 g (m gramų) bandinio ir įpilama 5 ml metanolio (8.1).
10.1.2. Kaitinama 10 minučių 500C temperatūros vandens vonioje (9.4), po to mėgintuvėlis dedamas į ultragarso vonią (9.5) ir laikomas, kol mėginys visiškai disperguosis.
10.1.3. Atvėsinama, po to centrifuguojama, esant 3500 aps./min., penkias minutes.
10.1.4. Virš nuosėdų esantis skystis perpilamas į 25 ml matavimo kolbą.
10.1.5. Mėginys dar kartą ekstrahuojamas 5 ml metanolio (8.1). Ekstraktai sumaišomi 25 ml matavimo kolboje.
10.1.6. Į 25 ml matavimo kolbą pipete įpilama 2,0 ml vidinio etaloninio pradinio tirpalo (8.6). Pripilama iki žymės metanolio (8.1) ir išmaišoma. Šis tirpalas yra naudojamas 10.4 punkte aprašytai analizei.
10.2. Chromatografija
10.2.1. Didelio slėgio skysčių chromatografijos įranga (9.2) sutvarkoma įprastu būdu. Judančiosios fazės (8.4) srauto greitis nustatomas 2,0 ml per minutę.
10.2.2. UV detektoriaus (9.2) bangos ilgis nustatomas 210 nm.
10.3. Kalibravimas
10.3.1. Įšvirkščiama po 10 ml kiekvieno benzilo alkoholio etaloninio tirpalo (8.7) ir išmatuojami benzilo alkoholio ir 4-etoksifenolio smailių plotai.
10.3.2. Kiekvienam etaloniniam benzilo alkoholio tirpalui (8.7) apskaičiuojami benzilo alkoholio ir 4-etoksifenolio smailių plotų santykiai. Kalibracinė kreivė brėžiama atidedant šiuos santykius ordinatės ašyje ir atitinkamas benzilo alkoholio koncentracijas mg mililitre abscisės ašyje.
10.4. Kiekio nustatymas
10.4.1. Įšvirkščiama 10 ml mėginio tirpalo (10.1.6) ir matuojami benzilo alkoholio ir 4-etoksifenolio smailių plotai. Apskaičiuojamas benzilo alkoholio ir 4-etoksifenolio smailių plotų santykis. Ši darbo eiga kartojama, įpilant po 10 ml (alikvotinę dalį) mėginio tirpalo, kol bus gauti pastovūs rezultatai.
10.4.2. Iš kalibracinės kreivės (10.3.2) nustatoma benzilo alkoholio koncentracija, atitinkanti benzilo alkoholio ir 4-etoksifenolio smailių plotų santykį.
11. Apskaičiavimas. Benzilo alkoholio kiekis mėginyje masės procentais apskaičiuojamas pagal formulę: [formulė šaltinio tekste pateikta paveikslėliu – žr. e-tar.lt]
% (m/m) benzilo alkoholio = ,
čia: m – analizei paimto mėginio (10.1.1) masė gramais; c – benzilo alkoholio koncentracija mėginio tirpale (10.1.6), nustatyta iš kalibracinės kreivės, mikrogramais mililitre.
III. Pakartojamumas
12. Jeigu benzilo alkoholio kiekis sudaro 1%, dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų skirtumas turi neviršyti 0,10%.