9 priedas

I. ATPAŽINIMAS

1. Šis metodas taikomas chininui, esančiam šampūnuose ir plaukų losjonuose, atpažinti.

2. Atpažįstama atliekant plonasluoksnę chromatografiją ant silikagelio. Chininas rūgščioje terpėje, esant 360 nm bangos ilgiui, fluorescuoja mėlynai. Norint papildomai patvirtinti chinino buvimą, fluorescencija gali būti panaikinama bromo garais, o amoniako garai sukels gelsvą fluorescenciją.

3. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni.

3.1. Silikagelio plokštelės be fluorescencijos indikatoriaus, 0,25 mm storio, 200 mm x 200 mm.

3.2. Judančiosios fazės tirpiklis – toluenas, dietileteris, dichlormetanas, dietilaminas, 20/20/20/8 (t/t/t/t).

3.3. Metanolis.

3.4. Sieros rūgštis (96%; d = 1,84).

3.5. Dietileteris.

3.6. Ryškinimo reagentas: į 95 ml dietileterio (3.5), esančio atvėsintame konteineryje, atsargiai įpilama 5 ml sieros rūgšties (3.4).

3.7. Bromas.

3.8. Amonio hidroksido tirpalas (28%; d = 0,90).

3.9. Chininas, bevandenis.

3.10. Etaloninis tirpalas: matavimo kolboje tiksliai pasveriama apie 100 mg bevandenio chinino (3.9) ir ištirpinama 100 ml metanolio (3.3).

4. Priemonės

4.1. Įprasta plonasluoksnės chromatografijos įranga.

4.2. Ultragarso vonia.

4.3. Miliporų filtras, FH 0,5 fm arba jam lygiavertis, su tinkama filtravimo įranga.

5. Darbo eiga

5.1. Mėginio paruošimas: 100 ml matavimo kolboje tiksliai pasveriamas toks bandinio kiekis, kuriame galėtų būti apie 100 mg chinino, ištirpinama ir pripilama iki žymės metanolio (3.3). Kolba užkemšama ir paliekama vienai valandai ultragarsiniame vibratoriuje (4.2) kambario temperatūroje. Filtruojama (4.3), šis filtratas naudojamas chromatografijai.

5.2. Plonasluoksnė chromatografija: 1,0 ml etaloninio tirpalo (3.10) ir 1,0 ml mėginio tirpalo (5.1) užlašinama ant silikagelio plokštelės (3.1). Chromatograma ryškinama naudojant tirpiklį (3.2) 150 mm atstumu kameroje, iš anksto prisotintoje tirpiklio (3.2).

5.3. Ryškinimas

5.3.1. Plokštelė išdžiovinama kambario temperatūroje.

5.3.2. Apipurškiama reagentu (3.6).

5.3.3. Plokštelė paliekama džiūti vieną valandą kambario temperatūroje.

5.3.4. Stebima UV lempos šviesoje, esant 360 nm bangos ilgiui. Chininas atrodo kaip ryškiai mėlynai fluorescuojanti dėmė.

5.3.5. Pagrindinių alkaloidų, giminingų chininui, RF vertės, kai ryškinama

tirpikliu (3.2):

Alkaloidas

RF

Chininas Chinidinas Cinchoninas Cinchonidinas Hidrochinidinas

0,20 0,29 0,33 0,27 0,17

5.3.6. Kad papildomai būtų patvirtintas chinino buvimas, plokštelė apytikriai vieną valandą yra veikiama bromo (3.7) garais. Fluorescencija išnyksta. Kai ši plokštelė yra veikiama amoniako (3.8) garais, vėl pasirodo dėmės, kurios turi būti rudos spalvos, o kai plokštelė yra vėl tikrinama 360 nm bangos ilgio UV šviesoje, galima stebėti gelsvą fluorescenciją.

5.3.7. Aptikimo riba – 0,1 mg chinino.

II. KIEKIO NUSTATYMAS

6. Šiuo metodu nustatomas chinino kiekis. Jis gali būti naudojamas nustatant didžiausią leidžiamą koncentraciją: šampūnuose – 0,5% (m/m), plaukų losjonuose – 0,2%.

7. Chinino kiekis, nustatomas šiuo metodu, yra išreiškiamas gaminio masės procentais (% m/m).

8. Tinkamai apdorojus analizuojamą bandinį, nustatymas atliekamas didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodu.

9. Reagentai. Jie turi būti naudojami analiziškai gryni ir tikti HPLC.

9.1. Acetonitrilas.

9.2. Kalio dihidroortofosfatas (KH2PO4).

9.3. Ortofosfato rūgštis (85%; d= 1,7).

9.4. Tetrametilamonio bromidas.

9.5. Chininas, bevandenis.

9.6. Metanolis.

9.7. Ortofosfato rūgšties tirpalas (0,1 M): pasveriama 11,53 g ortofosfato rūgšties (9.3) ir ištirpinama 1000 ml vandens matavimo kolboje.

9.8. Kalio dihidroortofosfato tirpalas (0,1 M): pasveriama 13,6 g kalio dihidroortofosfato (9.2) ir ištirpinama vandenyje 1000 ml matavimo kolboje.

9.9. Tetrametilamonio bromido tirpalas: 15,40 g tetrametilamonio bromido (9.4) ištirpinama vandenyje 1000 ml matavimo kolboje.

9.10. Eliuentas – ortofosfato rūgštis (9.7), kalio dihidroortofosfatas (9.8), tetrametilamonio bromidas (9.9), vanduo, acetonitrilas (9.1) 10/50/100/340/90 (t/t/t/t/t).

Šios judančiosios fazės sudėtis gali būti keičiama taip, kad sklaidos koeficientas

R būtų ≥ 1,5.

R = 2 ,

čia: R1 ir R2 – smailių sulaikymo trukmės minutėmis; W1 ir W2 – smailių pločiai pusėje aukščio milimetrais; d' – savirašio greitis milimetrais per minutę.

9.11. Kvarcas, apdorotas oktodecilsilanu, 10 mm.

9.12. Etaloniniai tirpalai: tiksliai pasveriama apie 5,0, 10,0, 15,0 ir 20,0 mg bevandenio chinino (9.5) atitinkamame skaičiuje 100 ml matavimo kolbų. Pripilama iki žymės metanolio (9.6) ir kolbų turinys kratomas, kol ištirpsta chininas. Kiekvienas bandinys filtruojamas per 0,5 mm filtrą.

10. Priemonės

10.1. Įprasta laboratorinė įranga.

10.2. Ultragarso vonia.

10.3. Didelio slėgio skysčių chromatografijos įranga su kintamo bangos ilgio detektoriumi.

10.4. Kolonėlė: ilgis – 250 mm; vidaus skersmuo – 4,6 mm; įkrova – kvarcas (9.11).

10.5. Miliporų filtras FH 0,5 mm arba jo atitikmuo su tinkamu filtravimo aparatu.

11. Darbo eiga

11.1. Mėginio paruošimas: 100 ml matavimo kolboje tiksliai pasveriamas toks bandinio kiekis, kuriame būtų 10,0 mg bevandenio chinino, įpilama 20 ml metanolio (9.6) ir kolba 20 minučių dedama į ultragarso vonią (10.2). Pripilama iki žymės metanolio (9.6). Tirpalas išmaišomas, po to filtruojamas (10.5).

11.2. Chromatografija: srauto greitis – 1,0 ml/min., detektoriaus (10.3) bangos ilgis – 332 nm, įšvirkščiamas tūris – 10 ml filtruoto tirpalo (11.1). Matuojamas smailės plotas.

11.3. Kalibracinė kreivė.

11.3.1. Įšvirkščiama ne mažiau kaip tris kartus po 10,0 ml kiekvieno etaloninio tirpalo (9.12), matuojamas smailių plotas ir apskaičiuojamas kiekvienos koncentracijos vidutinis plotas.

11.3.2. Brėžiama kalibracinė kreivė ir įsitikinama, kad ji yra tiesės pavidalo.

12. Apskaičiavimas

12.1. Pagal kalibracinę kreivę (11.3) nustatomas įšvirkštame tūryje esantis bevandenio chinino kiekis mg.

12.2. Bevandenio chinino koncentracija mėginyje masės procentais (% m/m) yra apskaičiuojama pagal tokią formulę:

% (m/m) bevandenio chinino = ,

čia: B – bevandenio chinino, nustatyto 10-yje mikrolitrų filtruoto tirpalo (6.1), kiekis mikrogramais; A – mėginio masė gramais (11.1).

III. PAKARTOJAMUMAS

13. Jeigu bevandenio chinino kiekis sudaro 0,5% (m/m), dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,02%.

14. Jeigu bevandenio chinino kiekis sudaro 0,2% (m/m), dviejų lygiagrečių to paties mėginio nustatymų rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,01%.